GB/T 23527.2-2025 酶造剂质量要求 第2部门：脂肪酶造剂

领域
本文件给出了脂肪酶造剂的产品分类，，，，，划定了技术要求、检验规定、标志、包装、运输和贮存，，，，，并描述了相应的试验步骤。。。。。。。
本文件合用于微生物发酵出产的脂肪酶造剂产品的出产、检验和销售。。。。。。。

术语和界说
下列术语和界说合用于本文件。。。。。。。
脂肪酶  lipase
能水解甘油三酯(含天然油脂)或脂肪酸酯产生单或双甘油酯或甘油和游离脂肪酸，，，，，在特定前提下也能催化酯合成和酯互换反映的酶。。。。。。。
脂肪酶造剂  lipase preparations
以脂肪酶为重要催化活性组分，，，，，通过造剂等工艺造得的产品。。。。。。。
注：造剂工艺中能参与有助于产品贮存、不变和使用的辅料。。。。。。。
脂肪酶活力  lipase activity
脂肪酶造剂的酶活力  activity of lipase preparations
1g固体脂肪酶造剂(或1mL液体脂肪酶造剂)含有的酶活力单元。。。。。。。
注1：以U/g(或U/mL)暗示。。。。。。。
注2：在肯定温度和pH前提下，，，，，脂肪酶每分钟水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，，，，，即为脂肪酶1个酶活力单元(以U暗示)。。。。。。。也能凭据所选取的酶活力测定步骤，，，，，另行约定相应的酶活力单元。。。。。。。

产品分类
按产品的利用领域
食品工业用和其他工业用脂肪酶造剂。。。。。。。
按产品的状态
固体剂型(含粉末剂型、颗粒剂型和固定化剂型)和液体剂型脂肪酶造剂。。。。。。。

要求
感官要求
应切合表1的划定。。。。。。。


理化要求
应切合表2的划定。。。。。。。


试验步骤
酶活力
凭据底物适应性，，，，，测定水解橄榄油底物的酶活力时，，，，，按附录A进行检测；；；；；；测定水解三丁酸甘油酯底物的酶活力时，，，，，可参考附录B。。。。。。。也可凭据现实需要选取其他步骤进行检测。。。。。。。

附录A  (规范性)
脂肪酶造剂活力的测定滴定法
A.1 道理
脂肪酶在肯定前提下，，，，，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油单酯和甘油，，，，，所开释的脂肪酸可用尺度碱溶液进行中和滴定，，，，，用pH计批示反映终点，，，，，凭据亏损的碱量，，，，，推算其酶活力。。。。。。。
反映式为：

A.2 试剂和资料
A.2.1 聚乙烯醇：聚合度1750±50。。。。。。。
A.2.2 橄榄油：试验试剂。。。。。。。
A.2.3 无水乙醇。。。。。。。
A.2.4 磷酸二氢钾。。。。。。。
A.2.5 十二水磷酸氢二钠。。。。。。。
A.2.6 氢氧化钠。。。。。。。
A.3 溶液配造
A.3.1 聚乙烯醇溶液(4%)：称取聚乙烯醇40g(精确至0.1g)，，，，，加水800mL，，，，，在沸水浴中加热，，，，，搅拌，，，，，直至全数溶化，，，，，冷却定容至1000mL。。。。。。。
注：凭据乳化成效和溶化情况，，，，，也能选择使用2％的聚乙烯醇溶液。。。。。。。
A.3.2 底物溶液：称量聚乙烯醇溶液150g，，，，， 加橄榄油50g，，，，，用高速匀浆机10000r/min处置6min(分2次处置，，，，，距离5min，，，，，每次处置3min)，，，，，水浴节造温度，，，，，处置过程中温度维持在60°C，，，，，处置实现后常温下磁力搅拌20min。。。。。。。底物溶液显微镜观察应有80％以上的液滴直径幼于或蹬宗3μm。。。。。。。该溶液现配现用。。。。。。。
注：也能选其他转速，，，，，并凭据乳化成效耽搁或缩短均质功夫。。。。。。。
A.3.3 磷酸缓冲溶液(pH=7.5)：别离称取磷酸二氢钾1.96g和十二水磷酸氢二钠39.62g，，，，，用水溶化并定容至500mL。。。。。。。如必要，，，，，调节溶液的pH至7.5±0.05。。。。。。。
A.3.4 氢氧化钠尺度溶液[c(NaOH)=0.05mol/L上按 GB/T 601 的划定配造与标定0.5mol/L氢氧化钠尺度滴定溶液。。。。。。。使用时，，，，，正确稀释10倍。。。。。。。
注：也能选取商品化的氢氧化钠尺度溶液。。。。。。。
A.3.5 乙醇溶液(95%，，，，，体积分数)。。。。。。。
A.3.6 酚酞批示液(10g/L)：按 GB/T 603 的划定配造。。。。。。。
A.4 仪器和设备
A.4.1 磁力搅拌水浴锅：±0.2°C。。。。。。。
A.4.2 电子天平：感量0.1mg。。。。。。。
A.4.3 移液器。。。。。。。
A.4.4 酸度计：精度±0.01。。。。。。。
A.4.5 秒表。。。。。。。
A.4.6 高速匀浆机。。。。。。。
A.4.7 电位滴定仪。。。。。。。
A.4.8 光学显微镜。。。。。。。
A.4.9 微量滴定管：10mL，，，，，分刻度≤0.05mL。。。。。。。
A.5 分析步骤
A.5.1 样品前处置
称取酶样品1.00g(精确至0.1mg)或1.0mL，，，，，参与适量磷酸缓冲溶液磁力搅拌溶化15min并稀释，，，，，稀释酶液选取玻璃器皿，，，，，测按季节造酶液浓度，，，，，样品与对照亏损碱量之差节造在1.0mL~2.0mL领域内，，，，，汲取样品时，，，，，应将酶液摇匀后再取。。。。。。。
注：酶会附着在塑料上，，，，，因而用玻璃器皿溶化稀释和滴定。。。。。。。使用塑料枪头短功夫转移的情况之表。。。。。。。
A.5.2 测定
A.5.2.1 电位滴定法(仲裁法)
按电位滴定仪使用说明书对仪器进行校对(若使用酸度计进行试验，，，，， 则依照酸度计说明书对酸度计进行校对)。。。。。。。
取4个100mL烧杯，，，，，于空缺杯(A)和样品杯(B1、B2、B3)中各参与4.0mL底物溶液，，，，，5.0mL磷酸缓冲溶液，，，，，再于A杯中参与15.00mL 95％乙醇溶液。。。。。。。40°C±0.2°C水浴中磁力搅拌预热5min，，，，，而后于空缺杯(A)和样品杯(B1、B2、B3)中各加1.00mL待测酶液，，，，，正确反映15min后，，，，，于样品杯(B1、B2、B3)中立即补加15.00mL 95％乙醇溶液终止反映。。。。。。。
在每个烧杯中加25mL蒸馏水，，，，，置于电位滴定仪上(若使用酸度计，，，，，则将酸度计电极放入烧杯中)，，，，，边搅拌，，，，，边用氢氧化钠尺度溶液滴定，，，，，直至pH10.3为滴定终点，，，，，纪录亏损氢氧化钠尺度溶液的体积。。。。。。。
注：对于某些脂肪酶样品参与25mL蒸馏水影响酶活检测了局，，，，，此类样品在终止反映后直接进行氢氧化钠尺度溶液滴定。。。。。。。
A.5.2.2 批示剂滴定法
取2个100mL锥形瓶，，，，，别离于空缺瓶(A)和样品瓶(B)中各参与底物溶液4.00mL和磷酸缓冲液5.00mL，，，，，再于A瓶中参与95％乙醇溶液15.00mL，，，，，于40°C±0.2°C水浴中预热5min，，，，，而后于空缺瓶(A)、样品瓶(B)中各加待测酶液1.00mL，，，，，立即混匀计时，，，，，正确反映15min后，，，，，于样品瓶(B)中立即补加95％乙醇溶液15.0mL终止反映，，，，，取出。。。。。。。
于空缺和样品溶液中各加酚酞批示液两滴，，，，，用氢氧化钠尺度溶液滴定，，，，，直至微红色并维持30s不褪色为滴定终点，，，，，纪录亏损氢氧化钠尺度溶液的体积。。。。。。。
A.6 推算
脂肪酶造剂的酶活力按公式(A .1)推算：

式中：
X₁——样品的酶活力，，，，，单元为酶活力单元每克或酶活力单元每毫升(U/g或U/mL)；；；；；；
V₁——滴定样品溶液时亏损氢氧化钠尺度溶液的体积，，，，，单元为毫升(mL)；；；；；；
V₂——滴定空缺溶液时亏损氢氧化钠尺度溶液的体积，，，，，单元为毫升(mL)；；；；；；
c ——氢氧化钠尺度溶液浓度，，，，，单元为摩尔每升(mol/L)；；；；；；
50——0.05mol/L氢氧化钠溶液1.00mL相当于脂肪酸50μmol；；；；；；
n₁——样品的稀释倍数；；；；；；
0.05——氢氧化钠尺度溶液浓度换算系数；；；；；；
15——反映功夫15min。。。。。。。
A.7 了局暗示
所得了局暗示至整数。。。。。。。
A.8 精密度
在沉复性前提下获得的两次独立测定了局的绝对差值应不超过算术均匀值的10%。。。。。。。

附录B  (资料性)
脂肪酶造剂活力的测定动态滴定法
B.1 步骤信息
B.1.1 道理
脂肪酶水解甘油三酯天生脂肪酸，，，，，使反映系统的pH降落。。。。。。。通过陆续参与碱的步骤维持反映系统的pH恒定。。。。。。。碱滴定的速度与酶活力成比例。。。。。。。酯酶的存在会使检测的脂肪酶的活力增长。。。。。。。蛋白酶的存在降解脂肪酶，，，，，从而使检测到的脂肪酶的活力减幼。。。。。。。
注：洗涤剂的存在会严沉影响本步骤。。。。。。。依分歧洗涤剂的类型和浓度分歧，，，，，这种影响阐发为从齐全抑造到激活。。。。。。。酶会附着在塑料上，，，，，因而用玻璃器皿溶化稀释和滴定，，，，，使用塑料枪头短功夫转移的情况之表。。。。。。。
B.1.2 反映式
反映式为：

B.1.3 反映前提
反映前提如下：
——温度：30°C±1°C；；；；；；
——pH：7.00；；；；；；
——底物浓度：0.16mol/L的三丁酸甘油酯；；；；；；
——反映功夫：至少1.5min(只有线性反映区用于推算斜率)。。。。。。。
B.1.4 分析领域
样品的分析领域为0.2U/mL~4.0U/mL。。。。。。。若是可能，，，，，所有样品在1.5U/mL~4.0U/mL的领域内被分析。。。。。。。
B.1.5 检测限
对于液体样品，，，，，检测限为20U/g，，，，，相当于2.5g样品溶化在10mL溶液中，，，，，而后再稀释25倍。。。。。。。对于固体样品，，，，，检测限为50U/g，，，，，相当于1.0g样品溶化在10mL溶液中，，，，，而后再稀释25倍。。。。。。。
B.2 仪器和设备
B.2.1 动态滴定(pH-stat)职能的滴定仪。。。。。。。
B.2.2 乳化器。。。。。。。
B.2.3 恒温水。。。。。。。壕取0.2°C。。。。。。。
B.2.4 温度计：精度±0.2°C。。。。。。。
B.2.5 自动移液器。。。。。。。
B.3 试剂
除非还有注明，，，，，在分析中仅使用确以为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。。。。。。。
B.3.1 三丁酸甘油酯(C₁₅H₂₆O₆)。。。。。。。
B.3.2 氯化钠(NaCl)。。。。。。。
B.3.3 磷酸二氢钾(KH₂PO₄)。。。。。。。
B.3.4 阿拉伯胶。。。。。。。
B.3.5 甘氨酸(H₂NCH₂COOH)。。。。。。。
B.3.6 甘油[HOCH₂CHCOH)CH₂OH]。。。。。。。
B.3.7 氢氧化钠片剂(NaOH)。。。。。。。
B.3.8 电极校对液(pH7.0)。。。。。。。
B.3.9 电极校对液(pH4.01)。。。。。。。
B.3.10 乙醇溶液(96%，，，，，体积分数)。。。。。。。
B.3.11 氮气(N₂)。。。。。。。
B.3.12 氢氧化钠溶液[c(NaOH)=1mol/L]：依照 GB/T 601 的划定配造。。。。。。。
B.3.13 氢氧化钠滴定液[c(NaOH)=0.025mol/L]：取氢氧化钠溶液25mL，，，，，用水稀释并定容至1000mL。。。。。。。配好后需用合适的设备脱气。。。。。。。
B.3.14 氢氧化钠滴定液[c(NaOH)=0.005mol/L上取氢氧化钠滴定液25mL，，，，，用水稀释并定容至5000mL。。。。。。。
B.3.15 乳化剂：移取约180mL去离子水于500mL烧杯中，，，，，参与搅拌子高速搅拌，，，，，再缓慢参与30.0g阿拉伯胶，，，，，持续搅拌至全数溶化。。。。。。。另取500mL烧杯，，，，，参与53.7g氯化钠和1.20g磷酸二氢钾，，，，，再参与350mL水充分溶化。。。。。。。将1620mL甘油置于3L容量瓶中，，，，，再顺次参与上述氯化钠-磷酸二氢钾溶液和阿拉伯胶溶液，，，，，最后以水定容并混匀。。。。。。。
B.3.16 底物乳剂：称取三丁酸甘油酯62.5g，，，，，别离量取乳化剂200mL和水940mL，，，，，混合。。。。。。。将混合液用匀浆器处置3min(7000r/min)。。。。。。。匀浆后的溶液吓酌通常的磁力搅拌器搅拌至少20min，，，，，而后调节pH至4.75±0.05。。。。。。。
注：分歧起源和批号的三丁酸甘油酯和阿拉伯胶对试验了局有影响，，，，，在更换产品或批号前需进行有效性确认。。。。。。。
B.3.17 甘氨酸缓冲液1(7.51g/L)：称取甘氨酸37.54g和氢氧化钠片剂18.5g，，，，，用水溶化并定容至5L。。。。。。。如必要，，，，，调节溶液的pH至10.8±0.05。。。。。。。
B.3.18 甘氨酸缓冲液2(0.75g/L)：取100mL甘氨酸缓冲液1，，，，，用水定容至1000mL。。。。。。。如必要，，，，，调节溶液的pH至10.8±0.05。。。。。。。
B.4 尺度曲线和样品处置
B.4.1 尺度曲线
称取肯定量的已知活力酶尺度品，，，，，精确至0.0001g，，，，，用甘氨酸缓冲液2溶化并稀释，，，，，造成尺度储蓄液。。。。。。。尺度储蓄液的浓度为20U/mL。。。。。。。而后依照表B.1配造溶液，，，，，并绘造尺度曲线。。。。。。。

B.4.2 尺度对照
可使用已知活力的样品作为尺度对照。。。。。。。尺度对照的处置同样品。。。。。。。
B.4.3 样品处置
分歧的样品需做分歧的预处置，，，，，以激活或保；；；；；ぴ谘坊手械闹久。。。。。。。
可思考选取甘氨酸缓冲液1和水来别离溶化和稀释样品的步骤，，，，，或选取甘氨酸缓冲液2来溶化和稀释样品的步骤，，，，，或直接用水溶化和稀释样品的步骤，，，，，以求得到最好的成效。。。。。。。样品的溶化液和稀释液需搅拌均匀。。。。。。。样品最终稀释到酶活力在1.5U/mL~ 4.0U/mL领域内。。。。。。。如可能，，，，，样品稀释完立即测定。。。。。。。
B.5 分析步骤
B.5.1 系两全备
B.5.1.1 依照无水乙醇、适当的肥皂水、热水、去离子水、底物的挨次洗濯滴定容器和管路。。。。。。。保障水浴的温度在30.0°C±0.5°C。。。。。。。
B.5.1.2 校对pH电极：使用前需校对pH电极的活络度在95%~102%；；；；；；pH7.00在6.985~6.989之间；；；；；；pH4.01在4.009~4.012之间。。。。。。。若是达不到此尺度，，，，，依照pH电极使用注明进行冲刷并再次校对。。。。。。。
B.5.2 分析
B.5.2.1 pH 电极用后浸泡在鼓和的氯化钾(KCl)溶液中，，，，，使用前冲刷。。。。。。。在反映溶液表表用氮气吹充，，，，，以预防空气中二氧化碳的滋扰。。。。。。。分析前肯定要保障底物的温度为30.0°C±0.5°C。。。。。。。在分析每个样品前要用0.005mol/L的氢氧化钠滴定液冲刷滴定皿和管路。。。。。。。
B.5.2.2 试验步骤如下。。。。。。。
——将15mL的底物参与滴定皿中。。。。。。。滴定前pH电极的读数应幼于7.0。。。。。。。
——加1mL样品稀释液参与滴定皿中。。。。。。。反映系统的pH在滴定过程中维持在7.0。。。。。。。纪录为维持恒定pH而参与的滴定液的量。。。。。。。
——滴定实现后滴定仪打印出滴定曲线线性领域的均匀斜率(若是使用分歧的设备，，，，，数据可能以其他大局输出)。。。。。。。滴定曲线需有一段持续1.5min的线性输出。。。。。。。
——先分析尺度曲线(每个尺度点分析一次)，，，，，再分析一个尺度对照，，，，，最后分析样品(每个样品分析一次)。。。。。。。需把稳，，，，， 一天内非一次运行的样品不能使用一样的尺度曲线。。。。。。。若是样品在当天晚些时辰分析，，，，，尺度溶液要沉新分析。。。。。。。
——每个样品分析前和最后一个样品实现分析后，，，，，系统将进行冲刷。。。。。。。排空底物容器和管路，，，，，并用乙醇冲刷。。。。。。。若是系统将在一周以上功夫不再使用，，，，，则需用去离子水进行冲刷并用氢氧化钠滴定液或一样浓度的盐酸溶液充斥敏感部件，，，，，预防出现盐类结晶。。。。。。。
B.6 推算
B.6.1 了局推算
利用尺度点的测定值作尺度曲线，，，，，其中X轴为尺度品酶活力，，，，，Y轴为相应的滴定反映的均匀斜率(mL/min)。。。。。。。尺度曲线为一条直线。。。。。。。样品稀释液的活力从尺度曲线中读出，，，，，而后按公式(B.1)推算：

式中：
X₂——样品的酶活力，，，，，单元为酶活力单元每克(U/g)或酶活力单元每毫升(U/mL)；；；；；；
A ——稀释样品在尺度曲线上读出的酶活力，，，，，单元为酶活力单元每毫升(U/mL)；；；；；；
V₃——样品溶化用的容量瓶体积，，，，，单元为毫升(mL)；；；；；；
n₂——第二次稀释的倍数；；；；；；
m₃——样品的质量或体积，，，，，单元为克(g)或毫升(mL)。。。。。。。
B.6.2 了局简直认
当满足以下前提时能够确认本次分析有效。。。。。。。
a) 尺度对照的检测值在本步骤所划定的可接受误差领域内。。。。。。。
b) 尺度曲线的斜率满足：
1) 尺度点1幼于0.02mL/min；；；；；；
2) 尺度点6在0.14mL/min~0.18mL/min之间。。。。。。。
c) 尺度曲线的有关系数(r²)大于或蹬宗0.995。。。。。。。
d) 尺度点3～点6有关系数(r²)大于0.9995。。。。。。。尺度点1～点2的r²大于0.995是可接受的。。。。。。。若是达不到此前提，，，，，查抄分析系统。。。。。。。
B.6.3 了局的暗示
了局给出3位有效数字。。。。。。。若是了局低于检测限，，，，，则暗示为幼于20U/g(液体)或幼于50U/g(固体)。。。。。。。
B.7 精密度
在沉复性前提下获得的两次独立测定了局的绝对差值应不超过算术均匀值的5%。。。。。。。


京都电子KEM 电位滴定仪&动态滴定(pH-stat)职能的滴定仪 AT-710S
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